Протокол in silico дизайна пептида, блокирующего взаимодействий типа I между доменами DED белков, участвующих в сборке сигнального комплекса DISC и регуляции апоптоза

Подготовка структурного каркаса

В качестве основы для дизайна DEDid используется NMR структура бычьего панкреатического полипептида (PDB: 1BBA) с характерной C-концевой α-спиралью и N-концевой пролин-богатой спиралью. Эта структура обеспечивает стабильную конформацию за счет упаковки типа “knob-into-holes”. Данная структура используется как основа для дальнейшей генерации связывающего пептида.

Процедура моделирования в программном пакете для макромолекулярного моделирования Rosetta

Моделирование выполняется в программном пакете Rosetta с использованием RosettaScripts. Протокол включает генерацию ансамбля из 100 конформаций комплексов DEDid/procaspase-8-DED1 (PDB: 5L08). После этого проводится отбор 10 конформаций с наименьшей энергией. Для каждой конформации выполняется структурная суперпозиция C_alpha атомов в спиральной области DEDid (остатки S26, R29, S30, L34, F33 и N37) на C_alpha атомы региона h2b каспазы-8 (остатки S115, R118, S119, F122, L123 и E126) с помощью PyMOL 2.0.

Оптимизация комплекса

Уточнение структуры проводится с использованием протокола Rosetta Protein-Protein Docking высокого разрешения. Процедура включает малые трансляционные и ротационные возмущения взаимодействующих субъединиц в ходе поиска методом Монте-Карло. Оптимизация затрагивает все остатки в пределах 15 Å от интерфейса взаимодействия. Для FADD DED используется структура мутанта F25Y (PDB: 1A1W). Далее проводится оптимизация боковых цепей с использованием функции оценки HBNet, учитывающей формирование сетей водородных связей. Финальная минимизация системы выполняется с помощью функции оценки ref15. В качестве альтернативного варианта данный этап можно выполнить в GROMACS.

Анализ и валидация

Из сгенерированных комплексов отбираются 10% структур с наименьшей энергией связывания. Кластеризация предсказанных поз связывания проводится по значениям RMSD координат C_alpha атомов с помощью программы Calibur. В качестве референсной выбирается структура, соответствующая центру наибольшего кластера. Структурное выравнивание procaspase-8-DED1 и PEA-15 выполняется с использованием структуры PDB: 4IZA. Модель подтверждает формирование ключевых гидрофобных взаимодействий между остатками L42, Y8, M43 procaspase-8-DED1 и F33, L34, I36 DEDid, а также образование водородных связей между R29 DEDid и D40 procaspase-8-DED1.

Результат моделирования

Молекулярное моделирование выявило, что разработанный пептид DEDid обладает уникальными структурными и функциональными свойствами для регуляции апоптоза. На структурном уровне DEDid точно воспроизводит ключевой элемент прокаспазы-8 - спираль h2b с консервативным FL-мотивом. Эта структурная имитация позволяет пептиду формировать специфические взаимодействия через гидрофобный кластер и сеть водородных связей с прокаспазой-8-DED1. Биохимические исследования методами ITC и NanoDSF подтвердили высокоспецифичное связывание DEDid с прокаспазой-8. Важно отметить, что точечные мутации в сайте связывания (L42S/Y8S) полностью блокируют это взаимодействие, подтверждая специфичность контакта. Pull-down эксперименты дополнительно показали способность DEDid взаимодействовать с другими белками, содержащими DED-домены - FADD и c-FLIP. Механистические исследования выявили, что DEDid действует как ингибитор апоптоза на нескольких уровнях. Во-первых, он нарушает формирование DED-филаментов, блокируя взаимодействия типа I между доменами. Во-вторых, дестабилизирует FADD-платформу в комплексе DISC. И наконец, предотвращает активацию каспазы-8, что в итоге блокирует развитие апоптоза. Таким образом, рациональный дизайн пептида DEDid позволил создать молекулярный инструмент, способный избирательно модулировать белок-белковые взаимодействия в сигнальном пути апоптоза через DED-домены.